Fondamenti di microscopia ottica e di formazione dell’immagine, limite risolutivo di uno strumento ottico. Metodi di contrasto in microscopia, con particolare rilievo alla fluorescenza. Microscopia non lineare (TPF, SHG, etc.) e vibrazionale (Raman, SRS, etc.). Proprietà ottiche e spettroscopiche dei campioni biologici. Digitalizzazione delle immagini e loro analisi. Super-risoluzione ottica. Applicazioni avanzate di microscopia in ambito biologico e medico.
J. Mertz, “Introduction to Optical Microscopy”, Roberts and Company Publishers (2009)
J. Pawley (ed.), “Handbook of Biological Confocal Microscopy”, Springer (2006)
Articoli e dispense forniti durante il corso.
Obiettivi Formativi
Il corso si propone di introdurre i fondamenti teorici e le principali applicazioni biomediche della microscopia ottica, e di esporre i più recenti sviluppi nel settore. Al termine del corso, lo studente dovrebbe conoscere vantaggi e limitazioni delle principali tecniche, ed essere in grado di comprendere e valutare criticamente un articolo specialistico nel settore.
Prerequisiti
Fondamenti dell’interazione radiazione-materia acquisiti nei corsi di Meccanica quantistica e/o Struttura della Materia. Nozioni di base di Ottica.
Metodi Didattici
Lezione frontale, visite ai laboratori
Altre Informazioni
Nessuna
Modalità di verifica apprendimento
Esame orale. Nell’esame verrà presentato e discusso un articolo specialistico. Verrà valutata la capacità di analisi critica, la padronanza della materia e le capacità espositive.
Programma del corso
I. Ottica del microscopio.
Concetti generali di ottica geometrica e radiometria (ingrandimento, apertura numerica, piani coniugati, invariante ottico). Il microscopio in ottica fisica: diffrazione della luce, propagatore del vuoto, propagatore della lente, ottica di Fourier, PSF e risoluzione. Il problema della risoluzione assiale. Sezionamento ottico. Microscopia confocale, microscopia a foglio di luce, microscopia ad onda evanescente (TIRFM). Aberrazioni in microscopia e loro correzione.
II. Spettroscopia molecolare e metodi di contrasto in microscopia.
Assorbimento, scattering. Microscopia a contrasto di fase, DIC, olografia digitale. Optical coherence tomography. Spettroscopia in fluorescenza (schema dei livelli, equazioni di rate, saturazione, fotobleaching). Microscopia a lifetime della fluorescenza (FLIM), trasferimento energetico risonante (FRET). Tipologie di fluorofori e tecniche di marcatura in vivo e ex vivo. Sensori funzionali (VSD, GCAMP, etc.). Proprietà ottiche dei tessuti biologici, cenni alle tecniche di schiarimento. Microscopia non lineare: eccitazione a due o tre fotoni, generazione di armoniche superiori. Microscopia vibrazionale: Raman spontaneo, Raman stimolato, CARS.
III. Acquisizione ed analisi dell’immagine.
Detector usati in microscopia: puntuali (PMT, APD) e array (CCD, CMOS). Caratteristiche generali (linearità, dark noise, electron well, etc.) e specifiche di ogni tipologia. Rumore di rivelazione. Principi di analisi dell’immagine: formati, filtri, deconvoluzione, segmentazione, quantificazione, strumenti principali (FIJI). Cenni alle tecniche di machine learning.
IV. Applicazioni e sviluppi avanzati.
Microscopia con sensibilità di singola molecola. Microscopie ottiche a super-risoluzione: luce strutturata, PALM/STORM, STED/RESOLFT. Microscopia in vivo. Tecniche di imaging 3D ad alta velocità. Optogenetica.
V. Laboratori.
Allineamento e caratterizzazione di un microscopio a campo largo. Caratterizzazione di un microscopio confocale. Analisi immagine con FIJI e Python.