Fondamenti di microscopia ottica, sia in trattazione di ottica geometrica che ottica fisica. Digitalizzazione delle immagini e loro analisi. Metodi di contrasto in microscopia, con particolare rilievo alla fluorescenza. Microscopia non lineare (TPF, SHG, etc.) e vibrazionale (Raman, SRS, etc.). Proprietà ottiche e spettroscopiche dei campioni biologici. Super-risoluzione ottica. Imaging e manipolazione di singole molecole.
J. Mertz, “Introduction to Optical Microscopy”, Roberts and Company Publishers (2009)
J. Pawley (ed.), “Handbook of Biological Confocal Microscopy”, Springer (2006)
Articoli e dispense forniti durante il corso.
Obiettivi Formativi
Il corso si propone di introdurre i fondamenti teorici e le principali applicazioni biomediche della microscopia ottica, e di esporre i più recenti sviluppi nel settore. Al termine del corso, lo studente dovrebbe conoscere vantaggi e limitazioni delle principali tecniche, ed essere in grado di comprendere e valutare criticamente un articolo specialistico nel settore.
Prerequisiti
Meccanica quantistica, Struttura, Ottica
Metodi Didattici
Lezione frontale, visite ai laboratori
Modalità di verifica apprendimento
Esame orale. Nell’esame verrà presentato e discusso un articolo specialistico. Verrà valutata la capacità di analisi critica, la padronanza della materia e le capacità espositive.
Programma del corso
1. Introduzione
2. Il microscopio: concetti generali di ottica geometrica e radiometria (ingrandimento, apertura numerica, piani coniugati, invariante ottico)
3. Il microscopio in ottica fisica: diffrazione della luce, propagatore del vuoto, propagatore della lente, ottica di Fourier, PSF e risoluzione
4. Aberrazioni in microscopia e loro correzione
5. Detector usati in microscopia: puntuali (PMT, APD) e array (CCD, CMOS). Caratteristiche generali (linearità, dark noise, electron well, etc.) e specifiche di ogni tipologia. Rumore di rivelazione.
6. Principi di analisi dell’immagine: formati, filtri, deconvoluzione, segmentazione, quantificazione, strumenti principali (FIJI)
7. Il problema della risoluzione assiale. Sezionamento ottico. Microscopia confocale, microscopia a foglio di luce, microscopia ad onda evanescente (TIRFM).
8. Metodi di contrasto in microscopia: campo chiaro, campo scuro, fluorescenza. Spettroscopia in fluorescenza (schema dei livelli, equazioni di rate, saturazione, fotobleaching).
9. Tipologie di fluorofori e tecniche di marcatura in vivo e ex vivo. Sensori funzionali (VSD, GCAMP, etc.) e optogenetica.
10. Proprietà ottiche dei tessuti biologici. Cenni alle tecniche di schiarimento.
11. Microscopia a contrasto di fase e DIC.
12. Microscopia non lineare: assorbimento a due fotoni e generazione di seconda armonica
13. Metodi di contrasto avanzati: lifetime della fluorescenza (FLIM), trasferimento energetico risonante (FRET), Raman spontaneo, Raman stimolato, coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS)
14. Optical coherence tomography e digital holography
15. Microscopia con sensibilità di singola molecola
16. Microscopie ottiche a super-risoluzione: luce strutturata, PALM/STORM, STED/RESOLFT
17. Manipolazione di singole molecole con pinzette ottiche (optical tweezers)
18. Laboratori: allineamento e caratterizzazione di un microscopio a campo largo. Analisi immagine con FIJI. Optical tweezers.